Dans l’hémostase et dans l’athérosclérose, en cas d’érosion de l’endothélium ou de rupture de la chape fibreuse, les plaquettes circulantes se trouvent au contact avec des éléments thrombogènes, ce qui entraîne la stimulation de leur activité procoagulante et la formation d’un thrombus. L’activation procoagulante des plaquettes est due à l’exposition rapide de la phosphatidylsérine (PS) du feuillet cytoplasmique sur le feuillet exoplasmique membranaire et s’accompagne de l’émission de microparticules. D’autres cellules (lymphocytes, monocytes etc…) en particulier lorsqu’elles sont présentes dans la plaque sont apoptotiques, et ont aussi un fort pouvoir pro-coagulant, ainsi que les microparticules qui leur sont associées.

Les mécanismes impliqués dans l’exposition des PS dans les plaquettes ne sont pas élucidés malgré plusieurs décennies de recherche. En particulier, on ne connait pas les mécanismes responsables du défaut d’exposition des PS dans le syndrome de Scott, maladie hémorragique héréditaire très rare caractérisée par un défaut de remodelage rapide de la membrane dans toutes les cellules d’origine hématopoïétique : plaquettes, érythrocytes, lymphocytes et lignées lymphocytaires immortalisées par infection avec le virus EBV (lymphoblastes).

Le projet porte sur l’étude des mécanismes associés à l’activation procoagulante, dépendante du Ca²⁺, au niveau de la membrane plasmique. L’identification des acteurs impliqués dans les plaquettes et cellules sanguines constitue un objectif majeur pour la conception d’agents anti-thrombotiques nouveaux visant à maîtriser le degré d’exposition de la PS procoagulante par les composants cellulaires et sub-cellulaires dans les régions où la thrombose peut survenir, comme au niveau de la plaque d’athérome.

Au cours des deux premières années, le travail de thèse a consisté à étudier le rôle des kinases et le rôle des mitochondries dans l’externalisation de la PS.

Les bases scientifiques et les résultats obtenus sont résumés ci-dessous :

A- Implication de la voie « extracellular signal-regulated kinases » (ERK) dans l’externalisation de la PS

Bases scientifiques

La voie ERK est impliquée dans l’activation plaquettaire conduisant à leur adhésion au sous-endothélium et à leur agrégation [1]. L’étude du transcriptome de lymphoblastes Scott a montré que le défaut génétique affecte les signaux régulant la transcription de gènes impliqués dans la progression de la croissance de ces cellules en culture [2]. Or une des voies de signalisation impliquées dans la régulation de la croissance et la différentiation cellulaire est la voie ERK. La stimulation des cellules de la lignée megacaryocytaire HEL par l’ionophore calcique A23187 active la voie ERK ainsi que l’exposition des PS [3]. Enfin, des inhibiteurs des kinases ERK sont utilisés dans le traitement des cancers colo-rénaux et dans les leucémies alors que les tests de l’hémostase de ces patients ne sont pas altérés [4].

Ces raisons ont motivé l’étude en détails de l’implication de la voie ERK dans l’exposition de la PS. Cette étude a été effectuée sur les plaquettes et des lignées de lymphocytes T Jurkat, et lymphoblastes B qui sont des modèles largement utilisés pour explorer les mécanismes d’exposition des PS.

Résultats obtenus

Les résultats ont confirmé que les kinases ERK sont transitoirement phosphorylées et les PS sont exposés dans toutes les lignées cellulaires stimulées avec les Ca2+-ionophores. Cependant l’exposition des PS a toujours lieu lorsque la voie ERK est inhibée. En étudiant la phosphorylation de ERK par des Ca2+ ionophores, d’abord dans un milieu en absence de Ca2+, puis en produisant un influx de Ca2+ par ajout de Ca2+ extracellulaire, une régulation de l’activation de ERK spécifique selon les cellules a été montrée pour la première fois : ERK est activée par phosphorylation en absence d’un influx de Ca2+ dans les plaquettes traitées par l’ionophore, alors qu’une entrée de Ca2+ est absolument nécessaire pour les Jurkat. Par contre un influx de Ca2+ est nécessaire à l’exposition de la PS dans les deux espèces cellulaires. Ce travail a aussi montré que les protéines ERK1 et 2 sont activées par phosphorylation à l’état basal dans des lymphoblastes B normaux et Scott, du fait de leur immortalisation par l’EBV [5], cependant sans exposition basale de la PS.

Conclusion

Ainsi, bien que l’activation de ERK ait lieu conjointement à l’exposition de la PS, ces résultats suggèrent que la voie ERK n’est pas le moteur du remodelage membranaire, et que d’autres signaux doivent être déclenchés pour l’induire. Ce résultat permet aussi de penser qu’une thérapie anticancéreuse à base d’inhibiteurs des MAPK kinases ne devrait pas augmenter le risque de saignement des patients (qui par ailleurs peuvent présenter un déficit plaquettaire du à l’effet des inhibiteurs sur la croissance des précurseurs). Cependant, la voie MAPK/ERK reste une cible potentielle antithrombique car elle est impliquée dans l’adhésion et l’agrégation plaquettaire [6], mais aussi dans l’athérosclérose et la rupture de plaque [7] [8].

Les résultats ont fait l’objet d’une publication : [9].

B-Exposition de la PS et implication de la chute du potentiel membranaire des mitochondries :

Bases scientifiques

De nombreux travaux ont montré que l’activation des plaquettes sanguines présente des caractéristiques morphologiques et biochimiques caractéristiques de l’apoptose, dont certaines impliquent les mitochondries, en particulier la transition de perméabilité mitochondriale (mPT) [10]. La mPT est la perméabilité soudaine des mitochondries aux ions et solutés, ce qui provoque la dissipation du potentiel mitochondrial (ΔΨm). Le phénomène est dû à l’ouverture d’un pore, le mPTP par entrée de Ca2+ dans la matrice mitochondriale, relarguant des facteurs apoptotiques (cytochrome c, caspases, AIF…). Une découverte importante a été que le mPTP peut être inhibé par la cyclosporine (CsA), qui s’associe avec un de ses constituants : la cyclophiline D (CypD). Une étude récente a montré que des plaquettes de souris CypD-/- ne sont pas procoagulantes lorsqu’elles sont stimulées avec la thrombine en présence de convulxine (Thr/Cvx), mais exposent normalement la PS par stimulation avec les Ca2+ ionophores [11]. Ce résultat suggère qu’avec les Ca2+-ionophores, le mPTP n’est pas impliqué. Par ailleurs, l’augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire par la thapsigargine (TG), un inhibiteur spécifique des Ca2+-ATPases du réticulum endoplasmique, stimule l’exposition des PS dans les plaquettes, mais pas dans les lymphocytes [12] [13].

Ainsi, selon les types cellulaires et les agents induisant une entrée de Ca2+, l’exposition des PS peut dépendre ou non du mPTP, et les caractéristiques peuvent être ou non communes à l’apoptose. Ce travail de thèse a eu pour but de clarifier le rôle du potentiel mitochondrial et l’effet de la CsA dans le remodelage rapide membranaire des plaquettes et des lignées cellulaires stimulées par les Ca2+ionophores et, dans les plaquettes, par la TG ou Thr/Cvx. Les mouvements calciques associés (cytosolique et mitochondrial) ont été explorés, ainsi que la protéolyse de protéines impliquées dans l’activation cellulaire et l’apoptose : calpaine, caspase 3 et Src, et la variation du ΔΨm significatif de l’ouverture du mPTP.

Résultats obtenus

En présence de Ca2+ extracellulaire, la TG et les ionophores de Ca2+ (3µM, 37°C) provoquent : i) une augmentation soutenue de Ca2+ cytosolique ; ii) un influx soutenu du Ca2+ dans la mitochondrie ; iii) la dissipation du ΔΨm ; iv) le remodelage membranaire. Ces effets suivis en cinétique, sont rapides (1-2 min). La présence de CsA (5µM, 3 min, 37°C) inhibe le remodelage membranaire par la TG et tous les évènements intracellulaires décrits ci-dessus. Par contre, lorsque les plaquettes sont stimulées par l’ionophore A23187, la CsA n’a aucun effet inhibiteur. Néanmoins il n’y a pas de lien de causalité entre dissipation du ΔΨm et remodelage membranaire, puisque les agonistes provoquent la chute du ΔΨm en absence de Ca2+ extra-cellulaire, condition où le remodelage n’est pas stimulé, et où l’augmentation de la concentration de Ca2+ cytosolique et mitochondrial est transitoire. Par stimulation avec le mélange Thr/Cvx (1U/500ng/ml) interagissant avec les récepteurs respectifs de ces agonistes et induisant une signalisation intracellulaire spécifique, seule une proportion (30-50 %) de la suspension totale des plaquettes exposent les PS et manifestent la chute du ΔΨm, et les deux réponses sont inhibées par la CsA [14]. En absence de Ca2+ extracellulaire, nous observons une chute faible du ΔΨm, en relation avec une augmentation transitoire faible de la concentration de Ca2+ mitochondrial, les deux étant peu ou pas affectées par la CsA. Dans les lignées lymphocytaires, contrairement aux plaquettes, l’ionomycine provoque le remodelage membranaire sans dissipation du ΔΨm. La CsA n’altère ni la cinétique de l’exposition des PS, ni celle de l’augmentation de la concentration de Ca2+ cytosolique.

Conclusion

Ces résultats permettent de proposer qu’il existe dans les plaquettes et les lymphocytes plusieurs mécanismes différents responsables de l’exposition des PS : l’un commun aux plaquettes et lymphocytes, mis en évidence avec les Ca2+-ionophores, les autres, également différents entre eux, étant observés dans les plaquettes stimulées en présence de TG ou de Thr/Cvx. Il est désormais important de définir les signaux mis en jeu, puisque nous n’avons pas confirmé dans tous les cas que la mPT et les mitochondries sont des acteurs dans l’exposition rapide et non apoptotique des PS, afin de rechercher si ces signaux induisent un processus final commun au niveau de la membrane.

Ces résultats font l’objet d’un article en cours de rédaction et ont été en partie présentés au congrès de l’International Society of Thrombosis and Haemostasis en 2007 à Genève [15].

[1] Oury, C., Toth-Zsamboki, E., Vermylen, J. and Hoylaerts, M.F. (2002). P2X(1)-mediated activation of extracellular signal-regulated kinase 2 contributes to platelet secretion and aggregation induced by collagen. Blood. 100, 2499-2505.
[2] Kozian, D., Proulle, V., Nitsche, A., Galitzine, M., Martinez, M.C., Schumann, B., Meyer, D., Herrmann, M., Freyssinet, J.M. and Kerbiriou-Nabias, D. (2005). Identification of genes involved in Ca2+ ionophore A23187-mediated apoptosis and demonstration of a high susceptibility for transcriptional repression of cell cycle genes in B lymphoblasts from a patient with Scott syndrome. BMC Genomics. 6, 146.
[3] Kunzelmann-Marche, C., Freyssinet, J.M. and Martinez, M.C. (2002). Loss of plasma membrane phospholipid asymmetry requires raft integrity. Role of transient receptor potential channels and ERK pathway. J Biol Chem. 277, 19876-19881.
[4] Zhang, W., Konopleva, M., Shi, Y.X., McQueen, T., Harris, D., Ling, X., Estrov, Z., Quintas-Cardama, A., Small, D., Cortes, J. and Andreeff, M. (2008). Mutant FLT3 : a direct target of sorafenib in acute myelogenous leukemia. J Natl Cancer Inst. 100, 184-198.
[5] Roberts, M.L. and Cooper, N.R. (1998). Activation of a ras-MAPK-dependent pathway by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 is essential for cellular transformation. Virology. 240, 93-99.
[6] Yacoub, D., Theoret, J.F., Villeneuve, L., Abou-Saleh, H., Mourad, W., Allen, B.G. and Merhi, Y. (2006). Essential role of protein kinase C delta in platelet signaling, alpha IIb beta 3 activation, and thromboxane A2 release. J Biol Chem. 281, 30024-30035.
[7] Fuhrman, B., Nitzan, O., Karry, R., Volkova, N., Dumler, I. and Aviram, M. (2007). Urokinase plasminogen activator (uPA) stimulates cholesterol biosynthesis in macrophages through activation of SREBP-1 in a PI3-kinase and MEK-dependent manner. Atherosclerosis. 195, e108-116.
[8] Williams, T.N., Zhang, C.X., Game, B.A., He, L. and Huang, Y. (2004). C-reactive protein stimulates MMP-1 expression in U937 histiocytes through Fc[gamma]RII and extracellular signal-regulated kinase pathway :: an implication of CRP involvement in plaque destabilization. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 61-66.
[9] Arachiche et col. ERK activation by Ca2+ ionophores depends on Ca2+ entry in lymphocytes but not in platelets, and does not conduct membrane scrambling. 2008, Cell Mol Life Sci 2008 Nov ;65(23):3861-71.
[10] Leung, R., Gwozdz, A.M., Wang, H., Bang, K.W., Packham, M.A., Freedman, J. and Rand, M.L. (2007). Persistence of procoagulant surface expression on activated human platelets : involvement of apoptosis and aminophospholipid translocase activity. J Thromb Haemost. 5, 560-570.
[11] Jobe, S.M., Wilson, K.M., Leo, L., Raimondi, A., Molkentin, J.D., Lentz, S.R. and Di Paola, J. (2008). Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis. Blood. 111, 1257-1265.
[12] Wurth, G.A. and Zweifach, A. (2002). Evidence that cytosolic calcium increases are not sufficient to stimulate phospholipid scrambling in human T-lymphocytes. Biochem J. 362, 701-708.
[13] Galitzine, M., Capiod, T., Le Deist, F., Meyer, D., Freyssinet, J.M. and Kerbiriou-Nabias, D. (2005). Ca2+ ionophores trigger membrane remodeling without a need for store-operated Ca2+ entry. Biochem Biophys Res Commun. 327, 335-341.
[14] Remenyi, G., Szasz, R., Friese, P. and Dale, G.L. (2005). Role of mitochondrial permeability transition pore in coated-platelet formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 467-471.
[15] Kerbiriou-Nabias, D.M., Arachiche, A., Garcin, I., Combettes, L., Geldwerth, D.,Freyssinet, J.M., Letellier, T., Dachary-Prigent, J. (2007). The rapid procoagulant membrane scrambling induced by calcium ionophores in platelets and lymphocytes is different from that induced by thapsigargin in platelets : demonstration with cyclosporin A. J Thromb Haemost. 5 Supplement 2 P-T-261